กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบ Cryogenic

อิเล็กตรอนกล้องจุลทรรศน์ Cryogenic ( Cryo-EM ) เป็นกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (EM) เทคนิคที่ใช้กับกลุ่มตัวอย่างในการระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิอุณหภูมิและฝังตัวอยู่ในสภาพแวดล้อมของน้ำน้ำเลี้ยง สารละลายตัวอย่างที่เป็นน้ำถูกนำไปใช้กับตะแกรงตาข่ายและแช่แข็งในอีเทนเหลวหรือส่วนผสมของอีเทนเหลวและโพรเพน [2]ในขณะที่การพัฒนาเทคนิคนี้เริ่มขึ้นในปี 1970 ความก้าวหน้าล่าสุดในเทคโนโลยีเครื่องตรวจจับและอัลกอริทึมของซอฟต์แวร์ทำให้สามารถกำหนดโครงสร้างทางชีวโมเลกุลที่ความละเอียดใกล้ระดับอะตอมได้ [3]สิ่งนี้ดึงดูดความสนใจอย่างกว้างขวางให้กับแนวทางนี้เป็นอีกทางเลือกหนึ่งของการตกผลึกด้วยรังสีเอ็กซ์หรือNMR spectroscopy สำหรับการกำหนดโครงสร้างโมเลกุลโดยไม่จำเป็นต้องตกผลึก

ภาพ Cryo-TEMของ GroELแขวนลอยอยู่ใน น้ำแข็งอสัณฐานที่ 50 000 ×ขยาย
ภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านความเย็น (cryoTEM) ของเซลล์ ARMAN ที่ยังไม่ถูกทำลายจากฟิล์มชีวภาพของ Iron Mountain ความกว้างของภาพ 576 นาโนเมตร
บอร์ด Cryo-electron ของ ไวรัสทางทะเลยักษ์ CroV
(แถบสเกลแทน 200 นาโนเมตร) [1]

ในปี 2017 รางวัลโนเบลสาขาเคมีมอบให้กับJacques Dubochet , Joachim FrankและRichard Henderson "สำหรับการพัฒนากล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอนสำหรับการกำหนดโครงสร้างที่มีความละเอียดสูงของสารชีวโมเลกุลในสารละลาย" [4] Nature Methodsยังตั้งชื่อ cryo-EM เป็น "Method of the Year" ในปี 2016 [5]

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Cryogenic (Cryo-TEM) เป็นอิเล็กตรอนเกียร์กล้องจุลทรรศน์เทคนิคที่ใช้ในโครงสร้างทางชีววิทยาและวัสดุศาสตร์

การพัฒนาในช่วงต้น

ในทศวรรษที่ 1960 การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านสำหรับวิธีการกำหนดโครงสร้างมีข้อ จำกัด เนื่องจากความเสียหายจากรังสีเนื่องจากลำแสงอิเล็กตรอนพลังงานสูง นักวิทยาศาสตร์ตั้งสมมติฐานว่าการตรวจสอบชิ้นงานที่อุณหภูมิต่ำจะช่วยลดความเสียหายจากรังสีที่เกิดจากลำแสง [11]ทั้งฮีเลียมเหลว (−269 ° Cหรือ 4 Kหรือ −452.2 ° F ) และไนโตรเจนเหลว (−195.79 ° Cหรือ 77 Kหรือ −320 ° F ) ได้รับการพิจารณาว่าเป็นความเย็น ในปีพ. ศ. 2523 Erwin KnapekและJacques Dubochet ได้เผยแพร่ความคิดเห็นเกี่ยวกับความเสียหายของลำแสงที่อุณหภูมิการแช่แข็งโดยมีข้อสังเกตว่า:

พบว่าผลึกบาง ๆ ที่ติดตั้งบนฟิล์มคาร์บอนมีความต้านทานลำแสงได้มากกว่าที่อุณหภูมิห้อง 4 K 30 ถึง 300 เท่า ... ผลลัพธ์ส่วนใหญ่ของเราสามารถอธิบายได้โดยการสันนิษฐานว่าการป้องกันด้วยความเย็นในพื้นที่ 4 K นั้นขึ้นอยู่กับ อุณหภูมิ. [12]

อย่างไรก็ตามผลลัพธ์เหล่านี้ไม่สามารถทำซ้ำได้และการแก้ไขได้รับการตีพิมพ์ในNatureเพียงสองปีต่อมาโดยแจ้งให้ทราบว่าความต้านทานของลำแสงมีนัยสำคัญน้อยกว่าที่คาดการณ์ไว้ในตอนแรก การป้องกันที่ได้รับที่ 4 K นั้นใกล้เคียงกับ "สิบเท่าสำหรับตัวอย่างมาตรฐานของ L-valine" [13]มากกว่าที่เคยระบุไว้

ในปี 1981 Alasdair McDowallและJacques Dubochetนักวิทยาศาสตร์จากEuropean Molecular Biology Laboratoryได้รายงานการใช้ cryo-EM ที่ประสบความสำเร็จเป็นครั้งแรก [14] McDowallและDubochet vitrifiedน้ำบริสุทธิ์ในฟิล์มบาง ๆ โดยการฉีดพ่นลงบนฟิล์มคาร์บอนที่ชอบน้ำซึ่งจมลงในcryogenอย่างรวดเร็ว( โพรเพนเหลวหรืออีเทนเหลวที่เย็นถึง 100 K) ชั้นน้ำแข็งอสัณฐานบาง ๆมีความหนาน้อยกว่า 1 µm และรูปแบบการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนยืนยันว่ามีน้ำแข็งอสัณฐาน / น้ำเลี้ยงอยู่ ในปี 1984 Dubochet ของกลุ่มแสดงให้เห็นถึงพลังของ Cryo-EM ในชีววิทยาโครงสร้างที่มีการวิเคราะห์vitrified adenovirusประเภท 2 T4 bacteriophage , ไวรัส Semliki ป่า , แบคที CBKและVesicular-Stomatitis-Virus [15]

2017 รางวัลโนเบลสาขาเคมี

ในปี 2560 นักวิทยาศาสตร์สามคนJacques Dubochet , Joachim FrankและRichard Hendersonได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีจากการพัฒนาเทคนิคที่จะสร้างภาพชีวโมเลกุล [4]

คู่ต่อสู้ที่อาจเกิดขึ้นกับการตกผลึกด้วยรังสีเอ็กซ์

ณ วันที่ 27 ตุลาคม 2020 X-ray crystallographyได้ถูกนำมาใช้ในการถ่ายภาพตัวอย่างทางชีววิทยา 150494 ตัวอย่างและเป็นเทคนิคที่โดดเด่นในกล้องจุลทรรศน์ชีวภาพโดยมี Cyro-EM อยู่ไกลสุดเพียง 6016 [16]

อย่างไรก็ตามตามธรรมชาติความก้าวหน้าในเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรง (มักเรียกว่า Direct Detection Devices หรือ DDDs) ที่มหาวิทยาลัยเคมบริดจ์[17]และการผลิตตัวอย่างอัตโนมัติโดยSPT labtech [18]ได้นำไปสู่การใช้เพิ่มขึ้นใน สาขาชีววิทยา[19]ทำให้ Cryo-EM เป็นคู่แข่งที่มีศักยภาพ

ความละเอียดของผลึกเอกซ์เรย์ถูก จำกัด ด้วยความบริสุทธิ์ของผลึก[20]และการสร้างตัวอย่างเหล่านี้ใช้เวลานานมากโดยใช้เวลานานถึงหลายเดือนหรือหลายปี [19]นอกจากนี้โปรตีนบางชนิดยังแข็งตัวได้ยาก [19] [21]แม้ว่าการเตรียมตัวอย่างสำหรับ Cryo-EM ยังคงเป็นเรื่องยาก แต่[22]ก็ไม่มีปัญหาเหล่านี้เนื่องจากสังเกตเห็นตัวอย่างใน "สถานะดั้งเดิม" [21]

จากข้อมูลของProteopediaความละเอียดค่ามัธยฐานที่ทำได้จากการตกผลึกด้วยรังสีเอ็กซ์ (ณ วันที่ 19 พฤษภาคม 2019) บนProtein Data Bankคือ 2.05 Å, [20]และความละเอียดสูงสุดที่ทำได้เป็นประวัติการณ์ (ณ วันที่ 27 ตุลาคม 2020) คือ 0.48 Å . [23]ความละเอียดของ Cryo-EM ใกล้ถึง 1.5 Åแล้ว[24]ทำให้เป็นคู่แข่งที่ยุติธรรมในการแก้ปัญหา

ในปี 2019 มีการใช้ Cyro-TEM และ Cryo-ET ที่สัมพันธ์กันในการสังเกตท่อนาโน (TNTs) ในเซลล์ประสาท [25]

การสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (cryoSEM) เป็นเทคนิคกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดด้วยระยะเย็นของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดในห้องแช่แข็ง

  1. ^ Xiao, C. , Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N. , Avila, GA และ Suttle, CA (2017) "การสร้าง Cryo-EM ใหม่ของ Cafeteria roenbergensis virus capsid แนะนำวิธีการประกอบใหม่สำหรับไวรัสยักษ์ ". วิทยาศาสตร์รายงาน , 7 : 5484.ดอย : 10.1038 / s41598-017-05824-W
  2. ^ Tivol วิลเลียม F.; บรีเกล, อาเรียน; Jensen, Grant J. (ตุลาคม 2551). "ดีขึ้น cryogen สำหรับน้ำแช่แข็ง" กล้องจุลทรรศน์และ microanalysis 14 (5): 375–379 ดอย : 10.1017 / S1431927608080781 . ISSN  1431-9276 PMC  3058946 PMID  18793481
  3. ^ Cheng Y, Grigorieff N, Penczek PA, Walz T (เมษายน 2015) "ไพรเมอร์สำหรับกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอนแบบอนุภาคเดี่ยว" . เซลล์ 161 (3): 438–449 ดอย : 10.1016 / j.cell.2015.03.050 . PMC  4409659 PMID  25910204
  4. ^ Cressey D, Callaway E (ตุลาคม 2017) "กล้องจุลทรรศน์ไครโออิเลคตรอนชนะรางวัลโนเบลสาขาเคมี" . ธรรมชาติ . 550 (7675): 167. Bibcode : 2017Natur.550..167C . ดอย : 10.1038 / nature.2017.22738 . PMID  29022937
  5. ^ Doerr, Allison (มกราคม 2017) "เอกซ์เรย์อิเลคตรอน". วิธีการธรรมชาติ 14 (1): 34. ดอย : 10.1038 / nmeth.4115 . ISSN  1548-7091 S2CID  27162203
  6. ^ Nannenga, Brent L; ชิ, แดน; เลสลี่แอนดรู GW; Gonen, Tamir (2014-08-03). "กำหนดโครงสร้างความละเอียดสูงโดยการเก็บรวบรวมข้อมูลอย่างต่อเนื่องในการหมุน MicroED" วิธีการธรรมชาติ 11 (9): 927–930 ดอย : 10.1038 / nmeth.3043 . PMC  4149488 . PMID  25086503 .
  7. ^ โจนส์คริสโตเฟอร์จี; Martynowycz, ไมเคิลดับเบิลยู; ฮัตน์โยฮัน; ฟุลตันไทเลอร์เจ; Stoltz, Brian M. ; โรดริเกซ, โฆเซ่เอ; เนลสันโฮเชยาม.; Gonen, Tamir (2018-11-02). "การ CryoEM วิธี MicroED เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับธุรกิจขนาดเล็กโมเลกุลโครงสร้างการกำหนด" ACS Central Science . 4 (11): 1587–1592 ดอย : 10.1021 / acscentsci.8b00760 . PMC  6276044 PMID  30555912
  8. ^ เดอลาครูซ, เอ็มเจสัน; ฮัตน์โยฮัน; ชิ, แดน; Seidler, พอล; โรดริเกซ, โชเซ่; เรเยส, ฟรานซิสอี; ซาวายา, ไมเคิลอาร์; คาสซิโอ, ดูอิลิโอ; ไวส์, Simon C (2017). "โครงสร้างอะตอมละเอียดจากผลึกโปรตีนแยกส่วนกับ cryoEM วิธี MicroED" วิธีการธรรมชาติ 14 (4): 399–402 ดอย : 10.1038 / nmeth.4178 . PMC  5376236 PMID  28192420
  9. ^ Gruene T, Wennmacher JT, Zaubitzer C, Holstein JJ, Heidler J, Fecteau-Lefebvre A, De Carlo S, Müller E, Goldie KN, Regeni I, Li T, Santiso-Quinones G, Steinfeld G, Handschin S, van Genderen E , van Bokhoven JA, Clever GH, Pantelic R (ตุลาคม 2018) "โครงสร้างการตัดสินใจอย่างรวดเร็วของสารโมเลกุล microcrystalline ใช้เลนส์อิเล็กตรอน" Angewandte Chemie 57 (50): 16313–16317 ดอย : 10.1002 / anie.201811318 . PMC  6468266 PMID  30325568
  10. ^ เฉิงอี้ฟาน (2018-08-31). "เดี่ยวอนุภาค Cryo-EM-วิธีมันไม่ได้รับที่นี่และที่มันจะไป" วิทยาศาสตร์ . 361 (6405): 876–880 ดอย : 10.1126 / science.aat4346 . ISSN  0036-8075 PMC  6460916 PMID  30166484
  11. ^ Dubochet J, Knapek E (เมษายน 2018) "อัพและดาวน์ในช่วงต้นอิเล็กตรอน Cryo-กล้องจุลทรรศน์" PLoS ชีววิทยา 16 (4): e2005550. ดอย : 10.1371 / journal.pbio.2005550 . PMC  5929567 PMID  29672565
  12. ^ Knapek E, Dubochet J (สิงหาคม 2523) "ความเสียหายของลำแสงที่มีต่อสารอินทรีย์จะลดลงอย่างมากในกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอน" วารสารอณูชีววิทยา . 141 (2): 147–61 ดอย : 10.1016 / 0022-2836 (80) 90382-4 . PMID  7441748
  13. ^ Newmark P (30 กันยายน 2525). "Cryo-transmission microscopy Fading hope" . ธรรมชาติ . 299 (5882): 386–387 รหัสไปรษณีย์ : 1982Natur.299..386N . ดอย : 10.1038 / 299386c0 .
  14. ^ ดูโบเชต์เจ; McDowall, AW (ธันวาคม 2524) "การละลายน้ำบริสุทธิ์สำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน" . วารสารจุลทรรศน์ . 124 (3): 3–4. ดอย : 10.1111 / j.1365-2818.1981.tb02483.x .
  15. ^ เอเดรียน, มาร์ค; ดูโบเชต์, ฌาค; Lepault, Jean; McDowall, Alasdair W. (มีนาคม 2527). "กล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอนของไวรัส" . ธรรมชาติ . 308 (5954): 32–36. ดอย : 10.1038 / 308032a0 . ISSN  0028-0836 PMID  6322001 S2CID  4319199
  16. ^ "RCSB PDB - โฮลดิ้งรายงาน" www.rcsb.org . สืบค้นเมื่อ2020-10-27 .
  17. ^ คัลลาเวย์เอเวน (2015-09-10). "การปฏิวัติจะไม่เป็นก้อน: วิธีการที่เรตติ้งใหม่ผ่านทางชีววิทยาโครงสร้าง" ข่าวธรรมชาติ . 525 (7568): 172. ดอย : 10.1038 / 525172 ก .
  18. ^ Baker, Monya (2018-09-25). "กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Cryo รูปร่างขึ้น" ธรรมชาติ . 561 (7724): 565–567 ดอย : 10.1038 / d41586-018-06791-6 .
  19. ^ Callaway, Ewen (2020-02-10). "Cryo-EM ปฏิวัติคือการไปชีววิทยาโครงสร้าง" ธรรมชาติ . 578 (7794): 201–201 ดอย : 10.1038 / d41586-020-00341-9 .
  20. ^ "การแก้ปัญหา - Proteopedia ชีวิตในแบบ 3 มิติ" proteopedia.org สืบค้นเมื่อ2020-10-27 .
  21. ^ "บริการ Cryo-EM - มีความคิด Biostructure" www.creative-biostructure.com . สืบค้นเมื่อ2020-10-27 .
  22. ^ Bhella, David (2019-08-01). "กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Cryo: แนะนำให้รู้จักกับเทคนิคและข้อควรพิจารณาเมื่อทำงานเพื่อสร้างสิ่งอำนวยความสะดวกแห่งชาติ" ความคิดเห็นทางชีวฟิสิกส์ . 11 (4): 515–519 ดอย : 10.1007 / s12551-019-00571-w . ISSN  1867-2469 PMC  6682334 PMID  31359340
  23. ^ ธนาคารข้อมูลโปรตีน RCSB "RCSB PDB" www.rcsb.org . สืบค้นเมื่อ2020-10-27 .
  24. ^ Bhella, David (2019-08-01). "กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Cryo: แนะนำให้รู้จักกับเทคนิคและข้อควรพิจารณาเมื่อทำงานเพื่อสร้างสิ่งอำนวยความสะดวกแห่งชาติ" ความคิดเห็นทางชีวฟิสิกส์ . 11 (4): 515–519 ดอย : 10.1007 / s12551-019-00571-w . ISSN  1867-2469 PMC  6682334 PMID  31359340
  25. ^ ซาร์โทรี - รัปป์, อันนา; คอร์เดโรเซร์บันเตส, ดิเอโก; เปเป้, แอนนา; กูเซท, คารีน; Delage, Elise; คอร์รอยเยอร์ - ดูลมอนต์, ไซม่อน; ชมิตต์, คริสติน; Krijnse-Locker, Jacomina; Zurzolo, Chiara (ธันวาคม 2019) "คู่กันกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Cryo เผยให้เห็นโครงสร้างของ TNTs ในเซลล์ประสาท" การสื่อสารธรรมชาติ 10 (1): 342. ดอย : 10.1038 / s41467-018-08178-7 . ISSN  2041-1723 PMC  6341166 PMID  30664666